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Rasierklingen
Bleistift
weißes Zeichenpapier
Filzstifte (= Schnellschreiber)
Objektträger
Deckgläser

Mikroskop
1 Glas Wasser
Pasteurpipetten mit Hütchen
Filtrierpapier
Kleenex - Tücher
Jod - Jodkaliumlösung
1 m Kaliumrhodanidlösung
Mörser + Pistill
Seesand
Aceton / Ammoniak / Essigsäure
Petrolbenzin
Zentrifugengläser
Reagenzgläser im Gestell
Parafilm
Dünnschichtplatte
Chromatographiepapier (SS 2043 b)
5 ml Pipetten
1 ml Pipetten
Schmelzpunktkapillaren
2 Bechergläser (500 ml)
Lösungamittelgemisch A (Petrolbenzin : Toluol : Chloroform : Isopropanol. 89 : 5 : 5 : 1)
Lösungsmittelgemisch B (Petrolbenzin : Isopropanol : Wasser. 100 : 12 : 0,25)
grüne Blätter (je nachdem, was wir in der kalten Jahreszeit auftreiben können)
Rotkohlblätter
Rote Beete
grüne und rote Paprika
Tomaten
Algenkultur (mit Spirogyra und Mougeotia)
50 ml Meßzylinder
Gestell mit Reagenzgläsern
2 n NaOH

An diesem Praktikumsnachmittag sollen zwei scheinbar unterschiedliche Phänomene bearbeitet werden.

Einmal die Trennung von Substanzen, zum anderen ein spezifisch und quantitativer Nachweis. Trennen und Nachweisen sind wesentliche Arbeitsgänge eines Biologen. Die Chromatographie, die wir heute in zwei Ausführungen kennenlernen werden, beruht auf der unterschiedlichen Löslichkeit der zu analysierenden Substanzen. Da die Methode standarisierbar ist, läßt sie sich auch zur Analyse und Charakterisierung unbekannter Substanzen heranziehen. Wir arbeiten mit farbigen Komponenten, um den Erfolg unseres Experiments kontinuierlich verfolgen zu können. So "nebenher" erkennen wir, welche Farbstoffe Blätter und Früchte enthalten. Lösungen farbiger Substanzen absorbieren Licht und je konzentrierter so eine Lösung ist, desto mehr Licht absorbiert sie, woraus folgt, daß man die Lichtabsorption auch zur Konzentrationsbestimmung verwenden kann. Die Photometrie ist in der Tat eine der wichtigsten Methoden zum Bestimmen kleiner Substanzmengen; das Spektralphotometer das hierfür erforderliche Gerät.

Aus rein praktischen Erwägungen heraus werden wir das Verfahren nicht heute an den Pflanzenfarbstoffen erarbeiten, sondern am kommdenden Nachmittag am Beispiel der Konzentration des Eiweißes im Eiklar. Jenes hat zwar den Nachteil, kein Licht des sichtbaren Bereichs zu absorbieren. Es kann jedoch chemisch umgesetzt werden, wobei ein Farbstoff entsteht, dessen Konzentration proportional zur Eiweißkonzentration ist.

Blätter und Früche enthalten Farbstoffe. Uns sollen in diesem Zusammenhang 2 Fragen interessieren:

1. Wo in den pflanzlichen Zellen sind die Farbstoffe lokalisiert?
2. Wie können wir sie isolieren?

Die erste Frage beantwortet man durch eine mikroskopische Untersuchung, die zweite, indem man das unterschiedliche Löslichkeitsvermögen der Farbstoffe ausnutzt.

Das Chlorophyll liegt in pflanzlichen Zellen nicht diffus verteilt vor; sein Vorkommen ist auf spezifische Strukturen, die Chloroplasten beschränkt. Betrachten Sie bitte im Mikroskop die Form und die relative Größe der Chloroplasten. Wo liegen sie in der Zelle? Enthalten alle Zellen Chloroplasten?

Die Chloroplasten aller höheren Pflanzen sind rundlich, linsenförmig bzw. ellipsiod. Bei einigen Algen jedoch findet man andere Formen, wie z.B. bandförmige Chloroplasten (bei Spirogyra) oder plattenförmige (bei Mougeotia). Beide Algengattungen, die zu den Grünalgen gehören, findet man relativ häufig in stehenden Gewässern.

Stellen Sie einen Längsschnitt durch eines der Ihnen vorliegenden Blätter her, indem Sie das Blatt über den Zeigefinger der linken Hand legen. Mit der Rasierklinge ein kleines und möglichst dünnes (transparentes) Stück der Oberfläche abtrennen.

Betrachten Sie Spirogyra. Der Chloroplast ist strukturiert. Sie finden im Inneren eine größere Zahl sogenannter Pyrenoidkörner. Diese enthalten Glykogen als einen Speicherstoff. Glykogen ist durch Jod - Jodkaliumzugabe nachweisbar.

Wie färbt sich hierdurch Glykogen ?

Der Chloroplast von Mougeotia ist in der Zelle um seine Längsachse drehbar und orientiert sich bei starkem Licht parallel zum Lichteinfall. Suchen Sie einige Chloroplasten, deren Flächen Sie sehen. Stellen Sie die Mikroskopierleuchte auf höchste Leistung und messen Sie die Zeit, die der Chloroplast zur Drehung benötigt.

Ziehen Sie jeweils ein Stück Epidermis ab und untersuchen Sie sie mikroskopisch. Was geschieht bei Zugabe einer im Kaliumrhodanidlösung? (Diesen Versuch brauchen Sie nur mit Rotkohl durchzuführen). Protokollieren Sie alle Beobachtungen. Stellen Sie Übersichtszeichnungen her. Achten Sie bitte auf die Proportionen. Wie groß sind die jeweiligen Strukturen im Vergleich zur ganzen Zelle?

In welcher Form liegen die gelben / roten Farbstoffe vor?

Diese Farbstoffe gehören der Stoffklasse der Carotinoide an.

Die Trennung von Pflanzenfarbstoffen beruht auf ihrer unterschiedlichen Löslichkeit in einigen Lösungsmitteln. Man unterscheidet zwischen polaren und nicht polaren Substanzen bzw. Lösungsmitteln. Zu den polaren gehören alle dissozierbaren Gruppen (Säuren und Basen), hierzu gehören aber auch einige chemische Gruppen, welche schwache Wechselwirkungen wie die Wasserstoffbrücken ausbilden können, z. B. die Hydroxylgruppe -OH, die Aminogruppe -NH₂ oder die Sulfhydrylgruppe -SH. Nicht polare Gruppen wie vor allem -CH₂-, -CH₃ sind hierzu nicht in der Lage.

Komplexere chemische Verbindungen, wie z. B. die Farbstoffe, die wir heute untersuchen wollen, enthalten sowohl polare wie auch nicht polare Gruppen, und es hängt von ihrem Verhältnis zueinander ab, ob die Verbindungen polar oder nicht polar reagieren. Wir kennen eine große Zahl von Lösungsmitteln, mit denen wir heute arbeiten könnten. Als polares Lösungsmittel werden wir Wasser verwenden, als nicht polares kommen die sogenannten organischen Lösungsmittel, also Kohlenwasserstoffverbindungen infrage, die man nach abnehmender Polarität ordnen kann:

Eine polare Substanz löst sich in einem polaren Lösungsmittel, eine nicht polare in einem nicht polaren; und dazwischen gibt es natürlich alle Übergänge.

Pflanzenfarbstoffe sind in gelöster Form sehr lichtempfindlich. Stellen Sie daher bitte alle Proben, mit denen sie gerade nicht arbeiten, in den Schrank unter Ihrem Arbeitstisch.

Zerreiben Sie das Ihnen vorgelegte Material mit wenig Sand im Mörser. Geben Sie zur Extraktion der Farbstoffe 2 - 3 Tropfen Ammoniak und 3 ml Lösungsmittel hinzu; und zwar

Wasser für Rote Beete und Rotkohl
Aceton für grüne Blätter und grüne Paprika
Petrolbenzin für rote Paprika

Es versteht sich von selbst, daß jede Probe für sich getrennt behandelt wird. Lassen Sie die Blattreste und vor allem den Sand absetzen. Dekantieren Sie den Überstand in ein kleines Zentrifugenglas. Sie sollen sich nur für den klaren, farbigen Überstand interessieren. Der Überstand muß intensiv gefärbt sein. Ist die Lösung nicht genügend konzentriert (intensiv gefärbt), kommen Sie bei den späteren Analysen in Schwierigkeiten.

Wasser und Petrolbenzin sind nicht miteinander mischbar. Beim Zusamenkippen beider Lösungen erhalten Sie zwei klar unterscheidbare Phasen.

Bestimmen Sie, welches die leichtere (obere) und welches die schwerere Phase ist.

1. Die Farbstoffe der roten Beete und des Rotkohls haben Sie mit Wasser extrahiert. Geben Sie zu je 1 ml Lösung 1 ml Petrolbenzin. Protokollieren Sie, wie sich der (die) Farbstoffe auf die beiden Phasen verteilen. Wiederholen Sie das Experiment sinngemäß mit den Farbstoffextrakten der roten Paprika und der Tomate.

2. Untersuchen Sie die Farbstoffe der roten Beete und des Rotkohls auf ihr Verhalten gegenüber Säuren oder Basen (Laugen). Sie brauchen je 2 x 0,5 ml Extrakt.

Sie können den im Experiment 1 eingesetzten Extrakt erneut verwenden. Geben Sie zu einem der beiden Teile einige Tropfen Säure (Essigsäure) und zum zweiten einige Tropfen Lauge (Ammoniaklösung).

Was beobachten Sie?
Ist die Reaktion reversibel?

Säuern Sie die alkalische Probe an. Machen Sie die saure Probe alkalisch. Wiederholen Sie disen Versuch einige Male, wenn möglich.

Gibt es Unterschiede zwischen Rotkohl und roter Beete?

Ihre Extrakte sind Gemische verschiedener Farbstoffe. Ihre Aufgabe ist es nun, die einzelnen Komponenten voneinander zu trennen. Im Prinzip geht man dabei so vor, wie Sie es bereits im Experiment 1 getan haben. Man untersucht, welche Komponente in welcher Phase besser löslich ist. Methodisch geschieht das wie folgt:

Man verteilt eine Substanz zwischen einer stationären und einer wandernden Phase. Dieses Verfahren nennt man Verteilungschromatographie. Als Träger der stationären Phase kann z.B. Cellulose (Papier) oder Kieselgur verwendet werden. Kieselgur wird mit einem Bindemittel als dünne Schicht auf eine Glasplatte aufgetragen. Man spricht deshalb von Dünnschichtchromatographie im Gegensatz zu Papierchromatographie, wo ein Stück Filterpapier als feste Phase (= Träger) dient. Man trägt die Substanz als kleinen Fleck nahe des unteren Randes des Trägers auf, und hängt, bzw. stellt diesen Träger in ein Lösungsmittelgemisch. Das Lösungsmittelgemisch wird am Papier, bzw, an der dünnen Kieselgurschicht durch Kapillarkräfte hochwandern und dabei die auf den Träger aufgetragenen Substanzen herauslösen (eluieren) und mitnehmen, vorausgesetzt, sie sind in dem Lösungsmittel löslich. Die Komponenten des Lösungsmittelgemisches werden vom Trägermaterial unterschiedlich gut adsorbiert, wodurch sich eine stationäre und eine wandernde Phase ausbildet. Diejenigen Komponenten werden wandern, die die schwächste Affinität zum Trägermaterial haben.

Je nach Löslichkeit bzw. je nach Adsorption wird sich ein Gleichgewicht einstellen, mit anderen Worten, je besser sich eine Substanz im wandernden Lösungsmittel löst, desto schneller wird sie wandern.

Hieraus ergibt sich als eine charakteristische Größe der Rf- Wert

Rf = Wanderungsstrecke der Substanz / Wanderungsgeschwindigkeit der Lösungsmittelfront

Der maximale Rf- Wert beträgt somit 1; meist liegt er darunter. Der Rf- Wert einer Substanz hängt von seiner chemischen Struktur, vom Träger und vom Lösungsmittelgemisch ab.

Wir arbeiten bei Papier und bei Dünnschicht mit unterschiedlichen Lösungsmittelgemischen, die in folgenden Verhältnissen angesetzt wurden

A (für Papier)

Petrolbenzin : Toluol : Chloroform : Isopropanol. 89 : 5 : 5 : 1

B (für Dünnschichtchromatographie)

Petrolbenzin : Isopropanol : Wasser. 100 : 12 : 0,25

Es gibt eine Reihe weiterer Mischungsverhältnisse, mit denen man ebenfalls zu guten Ergebnissen kommt. Sehen Sie es daher nicht als "Fehler" oder Widerspruch an, wenn Sie in irgendeiner anderen Praktikumsanleitung oder einem Praktikumslehrbuch etwas anderes finden. Wir haben eine Reihe solcher Gemische durchprobiert und mit manchen anderen gleich gute Ergebnisse erzielt, aber aus Zeitgründen im Praktikum haben wir uns auf eine Vorschrift einigen müssen, und uns für die oben genannte entschieden.

Die hier verwendete Plattengröße beträgt 10 x 6 cm; die Papiergröße 15 x 6 cm. Ziehen Sie mit dem Bleistift eine dünne, gerade sichtbare Startlinie 2 cm parallel zum unteren Rand der Platte und des Papiers. Im Abstand von 1 cm können Sie entlang der Linie Ihre Proben mit einer Schmelzpunktkapillare punktförmig auftragen. Achten Sie bitte darauf, daß der Durchmesser des Punktes nicht größer als 6 - 7 mm wird; das gelingt nur, wenn Sie die Kapillare nur bis zu einer Höhe von 5 mm füllen und die Platte oder das Papier nur kurz mit der Kapillarspitze in Berührung kommt. Nachdem die Substanz eingetrocknet ist, können Sie erneut einen Tropfen auftragen. Wiederholen Sie die Prozedur, bis der aufgetragene Punkt deutlich gefärbt erscheint.

Arbeiten Sie nicht zu langsam, und denken Sie vor allem daran, wie lichtempfindlich Ihre Substanzen sind.

Zum Auftragen auf das Papier legt man 2 Objektträger so unter das Papier, daß die Startlinie frei dazwischen liegt. Füllen Sie die 500 ml Bechergläser je ca. 1 cm hoch mit dem betreffenden Lösungsmittelgemisch und stellen Sie die Platte und das Papier hinein. Verschließen Sie das Glas mit Parafilm und stellen Sie den Reaktionsansatz ins Dunkle. Verfolgen Sie, was geschieht, brechen Sie das Experiment ab, wenn die Lösungsmittelfront etwa 75% - 80% des maximal möglichen Weges zurückgelegt hat.

Wie lange hat das gedauert?
Bestimmen Sie die Rf- Werte aller Farbstoffe.
Enthalten die Proben gleiche Komponenten?
Wodurch unterscheiden sich die Ergebnisse auf Papier von denen auf der Düunschichtplatte?

Zur schnellen und eindrucksvollen Demonstration der Chromatographie im Unterricht eignen sich die (aus unserem Praktikum verbannten) Schnellschreiber.

Lösungsmittel: Wasser

Löschpapier ist als Träger geeignet, im Gegensatz zu Kaffeefiltern, deren Textur kein sauberes Laufverhalten der Substanzen erlaubt.

(Wenn Sie heute noch etwas Zeit haben, probieren Sie es aus).